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伪狂犬病毒通用型(PRV-gH)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

更新时间:2022-04-23      点击次数:1859

伪狂犬病毒通用型(PRV-gH)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)


通用名称:伪狂犬病毒通用型(PRV-gH)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name :Pseudorabies Virus gH gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)又称猪疱疹病毒Ⅰ型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒[1]。猪是伪狂犬病的唯-一自然宿主,对其危害大。可致妊娠母猪流产,产死胎及胎儿干尸化。对初生仔猪则引起神经症状,出现运动失调,麻痹,衰竭死亡,病死率 100%。成年猪多呈隐性感染,但可引起呼吸道症状[2]。病猪、带毒猪及带毒鼠类是本病的主要传染源,病毒主要从病猪的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除,有的带毒猪可持续排毒一年。

本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理,检测伪狂犬病毒,对伪狂犬病毒引起的疾病及其并发症的诊断及疗效评

估有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对伪狂犬病病毒通用型特异性引物,结合一条特异性探针,用荧光 PCR 技术对伪狂犬病病毒通用型的 DNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格

50T/盒

PRV-gH 反应液

500μL×2 管

酶液

50μL×1 管

PRV-gH 阳性质控品

50μL ×1 管

阴性质控品

250μL ×1 管

说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀的猪,取脑、淋巴结、脾脏、肺脏等组织;待检活猪,用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等,   置于 50%甘油生理盐水中,或用注射器取血 5mL。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理(样本处理区)

1.1 样本前处理

组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0. 5g 于研磨器中研磨,加入

1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;分泌物棉拭子直接取 100μL 提取;血液取血清 100μL 提取。

1.2 核酸提取

推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按照    试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),单个测试反应液体系配制如下表:

试剂

PRV-gH 反应液

酶液

用量(样本数为 N)

20μL

1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21μL/管。

3. 加样(样本处理区)


将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。

4. PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;

荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择

ROX 参比荧光,选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置:

步骤

循环数

温度

时间

收集荧光信号

1

1 cycle

95℃

10min

2

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。

5.2 结果判断

阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;

可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性;

阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6. 质控标准

阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32;以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

7. 检测方法的局限性

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3. 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4. 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5. 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7. 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1. 所有操作严格按照说明书进行;

2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,*混匀并短暂离心;

3. 反应液应避光保存;

4. 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 娄高明,杜伟贤.伪狂犬病流行概况及猪场防制策略[J].中国动物检疫,1999,16(5):43-45.

[2] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社,1997.

[3] 国家质量监督检验检疫总局.GB/T 35911-2018 伪狂犬病病毒荧光 PCR 检测方法.[S].



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