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榛子源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒使用方法

更新时间:2022-04-26      点击次数:582


使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本 产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1.标记 个离心管,分别为 654321。


2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头, 下同。 

3. 在 号管中加入 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 

4. 换枪头,在 号管中加入 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 

5. 换枪头,在 号管中加入 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 分钟,得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 

6. 重复上面的操作直到得到 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。


二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 个样品待提取,最好设置 N+2 个提取,多出的是 PC(样品制备阳 性对照)和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液 10μL 再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作 为 PC。另外用水作为 NC

8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。

三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

9.如果做定量分析并且只做 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),个用于 PCR 阳性对照(用第 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加)


成分/每管样品管 N+2 PCR 阴性 对照管标准曲线 样品管(1-6 管)
2×Probe qPCR MagicMix10 μL10 μL10 μL
榛子源性成分探针法 qPCR 引物-探针混合液 μLμLμL
N+2 个待测 DNA 模板μL

超纯水
μL
第 步所得标准曲线样品稀释液 1-6 号)

μL(号样到 号管,号样到 号管

11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR

过程温度时间
预变性9510 min
PCR 反应 45 个循环)9515 sec
6060 sec(采集 FAM 通道的荧 光信号)
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