考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书

考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书

                                             微量法 100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

测定原理：

在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合形成蓝色复合物；该复合物在620nm处有最大吸收峰， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。

自备仪器和用品：

离心机、酶标仪、96孔板、移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体11 mL×1瓶，4℃保存。

样品中可溶性蛋白质提取：

1.        液体样品：澄清液体样品可以直接测定。

2.        组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：20的比例（建议称取约0.05 g组织，加入1mL提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））

冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

3.        细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

1. 酶标仪预热30 min。

2. 在96孔板中加入：

注意：空白管只需要测定一次。

计算公式：

标准曲线：y = 7.1265x - 0.0007  R² = 0.9997    x: 蛋白标准品浓度(mg/mL)

                                                y: 吸光值差值

1.按液体样本体积计算：

Cpr（mg/mL）=(△A+0.0007)÷7.1265

                                =0.1403×(△A+0.0007)

2.按组织样本质量计算：

                   Cpr（mg/g）=(△A+0.0007)÷7.1265×V总÷W          

                                                                       =0.1403×(△A+0.0007)÷W

V总：提取液体积，1 mL; W：样本质量，g。