脲酶（Urease， UE）测定试剂盒说明书

脲酶（Urease， UE）测定试剂盒说明书

                                    微量法100管/48样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。UE活性与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关，反应了氮素状况。

测定原理：

利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH₃-N。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1瓶，临用前加入9mL蒸馏水，充分溶解待用，4℃保存；用不完的试剂4℃保存；

试剂二：液体22mL×1瓶，4℃保存；

试剂三A液：液体×1支，4℃保存；试剂三B液：液体×1瓶，4℃保存；临用前将A液倒入B液中混合，待用；用不完的试剂4℃保存一周；

试剂四：液体2mL×1瓶，4℃保存；

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至578nm，蒸馏水调零。

2、酶促反应

混匀，放入37℃水浴1h后，10000g 25℃离心10min，取上清液。

2、将上清液稀释10倍（取0.1mL上清液，加入0.9mL蒸馏水）。

3、测氨量（在微量石英比色皿或96孔板中加入下列试剂）

充分混匀，室温放置20min

混匀，于578nm处，蒸馏水调零，读吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

UE活力计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.0915x +0.0373；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值A。

1、血清（浆）UE活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

UE活力（μg/min/mL）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反总÷V样÷T=27.32×(ΔA -0.0373)

单位的定义：每天每g土样中产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

2、组织、细菌或细胞中1μg NH₃-N活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

UE活力（μg/min/mg prot）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反总÷(V样×Cpr)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

UE活力（μg/min/ g 鲜重）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

UE活力（μg/min/10⁴ cell）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反总÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.0546×ΔA

10：稀释倍数；T：反应时间，60min； V反总：反应体系总体积：0.3mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量， g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.04575x +0.0373；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值A。

1、血清（浆）UE活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

UE活力（μg/min/mL）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反总÷V样÷T=54.64×(ΔA -0.0373)

单位的定义：每天每g土样中产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

2、组织、细菌或细胞中1μg NH₃-N活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

UE活力（μg/min/mg prot）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反总÷(V样×Cpr)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

UE活力（μg/min/g 鲜重）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1μg NH₃-N定义为一个酶活力单位。

UE活力（μg/min/10⁴ cell）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反总÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.1092×ΔA

10：稀释倍数；T：反应时间，60min； V反总：反应体系总体积：0.3mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量， g；500：细菌或细胞总数，500万。