脂肪酸合成酶（FAS）活性试剂盒说明书

脂肪酸合成酶（FAS）活性试剂盒说明书

                                                         微量法100T/96S

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

FAS是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。

测定原理：

FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP⁺；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP⁺没有；通过测定340nm 光吸收下降速率，计算FAS活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，－20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解冻后混匀。

试剂二：粉剂×1瓶。临用前加入440μL试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入440μL试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：液体20mL×1瓶, 4℃保存。

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入840μL试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

粗酶液提取：

1.        组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心40min，取上清置冰上待测。

2.        细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后12000g，4℃，离心40min，取上清置于冰上待测。

3.        血清等液体：直接测定。

FAS测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂四置于40℃水浴中预热30 min。

3. 在96孔板或EP管中依次加入20μL上清液、4μL试剂二、4μL试剂三、164μL试剂四和8μL试剂五，混匀后于340nm处测定吸光值，记录第30s和90s时吸光值，分别记录为A1和A2。△A测=A1-A2。

FAS活性计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷(Cpr×V样)÷T

=1608×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol/min/g 鲜重) = (△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷(W×V样÷V样总)÷T

=1608×△A ÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol /min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=1608×△A ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：37℃中每毫升样本每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷V样÷T

=1608×△A

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。

b. 使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷(Cpr×V样)÷T

=3216×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol/min/g 鲜重) = (△A÷ε÷d×V反总×10⁹) ÷(W×V样÷V样总)÷T

=3216×△A÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol /min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=3216×△A÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：37℃中每毫升样本每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反总×10⁹ )÷V样÷T

=3216×△A

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。