总胆固醇（total cholesterol，TC）含量测定试剂盒说明书

总胆固醇（total cholesterol，TC）含量测定试剂盒说明书

                                                   微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

TC包括游离胆固醇和胆固醇酯。TC是指组织中所有脂蛋白所含胆固醇之总和。

测定原理：

利用酯酶催化胆固醇酯水解生成游离胆固醇（FC）和游离脂肪酸（FFA），从而把胆固醇酯转化为FC；进一步利用胆固醇氧化酶催化FC氧化，生成△4-胆甾烯酮和H₂O₂；最后利用过氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安替比林和酚，生成红色醌类化合物；在500nm有特征吸收峰，其颜色深浅与TC含量成正比。

自备仪器和用品：

水浴锅、可调式移液枪、酶标仪、96孔板。

试剂组成和配置：

试剂一：异丙醇100mL（自备）；

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；

试剂四：液体40μL×1瓶，4℃保存；

TC标准品：液体1mL×1支，0.5μmol/mL，4℃保存。

TC的提取：

1、组织中TC的提取：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清，即TC待测液。

2、细胞、细菌中TC的提取：先收集400-500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加1mL试剂一，超声波破碎1min（强度20％，超声2s，停1s），即TC待测液。

3、血清（浆）等样品：直接测定。

测定操作：

1. /酶标仪预热30 min，调节波长到500 nm。

2. TC工作液的配制：临用前，吸取约0.8mL试剂二分别加入试剂三和试剂四瓶中，充分溶解后再全部转移回试剂二瓶中，充分混匀，TC工作液置于37℃水浴10min。用不完的工作液4℃保存一周。

3. 标准管：依次在96孔板中加入20μL FC标准液和180μL TC工作液，混匀，37℃静置3h后于500nm测定A标准管。

4. 测定管：依次在96孔板中加入20μL FC待测液和180μLTC工作液，混匀，37℃静置3h后于500nm测定A测定管。

5. 空白管：依次在96孔板中加入20μL 试剂一和180μLTC工作液，混匀，37℃静置3h后于500nm测定A测定管。

注意：标准管和空白管只需测定一次。

计算公式：

1. 血清（浆）中TC含量计算：

TC（μ mol /dL）=C标准液×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）×100

=50×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）

C标准液：0.5μmol/mL；100 mL：1dL=100 mL。

2. 组织中TC含量计算：

(1)按样本蛋白浓度计算

TC（μ mol / mg prot）= C标准液×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr

   = 0.5×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr

(2)按样本质量计算

TC（μ mol / g 鲜重）= C标准液×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷W

   = 0.5×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷W

C标准液：0.5μmol/mL；样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL

3. 细胞、细菌中TC含量计算：

TC（μ mol /10⁴ cell）=C标准液×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷细菌或细胞（10⁴ cell /L）

   =0.5×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷细菌或细胞（10⁴ cell /L）

C标准液：0.5μmol/mL。

Z低检出限为1nmol/mL。