磷脂酶C（ Phospholipases C，PLC ）试剂盒说明书

磷脂酶C（ Phospholipases C，PLC ）试剂盒说明书

 微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

磷脂酶C（EC3.1.4.3）是一种水解甘油磷酸酯C3位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶，广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中，在细胞代谢、细胞传递、生长发育等方面具有重要作用。

测定原理：

磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯酚，在410nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体102mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体8mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取：

1.        组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。

2.        细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。

3.        血清：直接测定。                  

测定操作：

酶活计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0191x - 0.0103，R² = 0.9991

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样×Cpr) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T

                          = 17.45×（△A+0.0103）÷ W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性（nmol/min/10⁴ cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T

                          = 17.45×（△A+0.0103）÷ 细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷V样÷T

                       = 17.45×（△A+0.0103）

V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min

b.       用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0095x - 0.0103，R² = 0.9991

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样×Cpr) ÷T

                           = 35.09×（△A+0.0103）÷ Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T

                          = 35.09×（△A+0.0103）÷ W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性（nmol/min/10⁴ cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T

                    =35.09×（△A+0.0103）÷ 细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷V样÷T

                    = 35.09×（△A+0.0103）

V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min