脂蛋白酯酶（Lipoprotein lipase，LPL）试剂盒说明书

脂蛋白酯酶（Lipoprotein lipase，LPL）试剂盒说明书

微量法100T/48S

注      意  ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

脂蛋白酯酶是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞及巨噬细胞等实质细胞合成的一种酶，可催化甘油三脂水解为脂肪酸和单酸甘油酯，以供组织氧化供能和贮存，并在不同的组织表现出不同的生理意义。

测定原理：

脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕榈酸酯产生4-硝基苯酚，在400nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、冷冻离心机、研钵、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。

试剂组成和配制 ：

试剂一：液体105mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体4mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。

样品处理：

1.        组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清待测。

2.        细胞：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心10min，取上清待测。

3.        血清：直接测定。

测定操作：

计算公式：

a.        用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y= 0.0581x -0.0169，R²=0.9982

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫克蛋白每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.0169）÷ 0.0581×V反总÷（V样×Cpr）÷T

= 17.21×（△A+0.0169）÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每克组织每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL活性（μmol /min/g 鲜重）=（△A+0.0169）÷0.0581×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

= 17.21×（△A+0.0169）÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每10⁴个细胞每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL活性（μmol /min/10⁴ cell）= （△A+0.0169）÷0.0581×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

                                        = 17.21×（△A+0.0169）÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫升血清每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.0169）÷0.0581×V反总÷V样÷T

                                 = 17.21×（△A+0.0169）

V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中加入样本体积，0.02mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min

b．用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y= 0.029x -0.0169，R²=0.9982

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫克蛋白每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.0169）÷ 0.029×V反总÷（V样×Cpr）÷T

= 34.42×（△A+0.0169）÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每克组织每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL活性（μmol /min/g 鲜重）=（△A+0.0169）÷0.029×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

= 34.42×（△A+0.0169）÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每10⁴个细胞每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL活性（μmol /min/10⁴ cell）= （△A+0.0169）÷0.029×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

                                        =34.42×（△A+0.0169）÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫升血清每分钟水解产生1μmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.0169）÷0.029×V反总÷V样÷T

                                 = 34.42×（△A+0.0169）

V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中加入样本体积，0.02mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min

注意事项：

1.        试剂三加入混匀后静置两分钟立即测定，否则影响吸光值。

2.        吸光值过高或者测定结果不稳定，则将酶液进行适当的稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。