中性转化酶（Neutral invertase, NI）试剂盒说明书

中性转化酶（Neutral invertase, NI）试剂盒说明书

                                         微量法100管/48样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH，将高等植物Ivr分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。                          

NI主要存在于细胞质中，负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。

测定原理：

NI催化蔗糖分解产生还原糖，进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在510nm有特征光吸收，在一定范围内510nm光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算NI活性

自备用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存;

试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存;

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10mL试剂一充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存；

试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤和加样表：

1、   分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至510nm，蒸馏水调零。

2、样本测定，（在EP管中依次加入下列试剂）：

混匀， 37℃准确水浴30min后，95℃水浴10min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变）

混匀，95℃水浴10min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中， 510nm处记录各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸馏水稀释后测定（计算公式中乘以相应稀释倍数），ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

NI活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.0016x -0.001；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。

（1）按蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鲜重计算：

单位的定义：37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

NI活性（μg/min /g 鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.0008x -0.001；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。

（1）按蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鲜重计算：

单位的定义：37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

NI活性（μg/min /g 鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。