小鼠胚胎干细胞

ES-E14TG2a

细胞描述：

小鼠胚胎干细胞。该细胞缺乏 HGPRT（HPRT），并且对 0.06 mM 的 6-硫鸟嘌呤有抗性。当在饲养层（胚胎成纤维细胞或 STO 细胞）上培养时，细胞保持未分化状态。在没有饲养层的情况下，细胞自发分化并形成胚胎结构。当注入胚泡中时，细胞可以进入生殖系。在常规的分子基因修饰技术之后，它们可用于重构小鼠胚胎。培养时需使用昆明白MEF作为饲养层细胞。

细胞特性

1）  来源：小鼠，129/Ola品系，胚胎内细胞团

2）  形态：球形克隆 贴壁生长

3）  含量：>1x106  细胞数

4）  规格：1mL冻存管包装

5）  用途：仅供科研使用

运输和保存：干冰运输：1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM 基础培养基      81%

优质胎牛血清           15 %

GlutaMAX-1谷氨酰胺       1 %

MEM NEAA非必需氨基酸    1%

Sodium Pyruvate丙酮酸钠   1%

P/S青霉素-链霉素        1%

β-巯基乙醇       0.5 mL（1000X)

LIF                       5μg（10ng/mL）

使用昆明白MEF作为饲养层细胞。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：完培养液 60%，FBS 30%，DMSO 10%现用现配。

我库冻存时，体积为 500 μl，预期存活率 70%，每支冻存管的细胞复苏，3 至4 天后，会形成 30 至 40 个克隆，建议复苏至 1 个 T25 培养瓶中。

二：细胞处理：

MEF 细胞铺制：

1. 在 T25 培养瓶中加入 0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于 37℃细胞培养箱至少放置 15 min 以上。

2. 吸除 0.2%明胶，加入事先水浴加热至 37℃的 MEF 完培养液。一般地，一个 T25 培养瓶中加入 5 ml MEF 完培养液。

3.  按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；复苏 MEF 细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

4. 将冻存管内细胞悬液转移至含 2 ml MEF 完培养液的 15 ml 离心管内，以1000 rpm，离心 5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的 MEF 完培养液 1 ml，重悬后按照一个 T25 培养瓶铺 1106 的 MEF 细胞，平均加入到 T25 培养瓶中，轻轻摇匀后置于 37℃细胞培养箱。24 h 以后可以传入小鼠胚胎干细胞。

5.复苏或传代小鼠胚胎干细胞前，将 T25 培养瓶中的 MEF 完培养液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干细胞完培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完培养液待用。

复苏：

1.将小鼠胚胎干细胞冻存管从液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。

2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干细胞完培养液的 15ml 离心管内，以 1000 rpm，离心 5 min。

3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完培养液 2 ml，吹打悬浮。

4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。

5.  转移至 1 个已经铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中培养。

6. 每天更换小鼠胚胎干细胞完培养液。

传代：

1. 一般在复苏后第 2-3 天传代，视克隆大小和密度而定

2. 吸除废液。

3. 用 PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于 37℃培养箱内消化细胞。

5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干细胞完培养液终止消化。

7.  以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清。

8. 加入约 1 ml 小鼠胚胎干细胞完培养液，多次轻轻吹打细胞， 制成单细胞悬液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干细胞完培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中。一般地，一个 T25 培养瓶加入 5-6 ml 培养液。放入 37℃培养箱内培养。每天换液。

传代比例：1:4-1:7

冻存：

1.按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。

2.  以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。

3. 按每支存管内加入 500 ml 细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。

4．将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：

小鼠胚胎干细胞完培养液 60%，ES 级 FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：

1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完培养液重悬细胞， 吹打混匀，细胞悬液分装到无 MEF 细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25 培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个 10 cm 培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞）中。

2. 培养皿或培养瓶置于 37°C 培养箱内静置 1 小时。

3.  1 小时后，绝大部分 MEF 细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。收取培养液，进行后续实验。

注意事项：

1. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

2. 建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。