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荧光定量RT-PCR试剂盒(两步法)

简要描述:荧光定量RT-PCR试剂盒(两步法)是整合 cDNA 第一链合成试剂(RT 试剂盒)和即用型 qPCR 试剂而得的qRT-PCR 试剂盒。cDNA 第一链合成反应和 qPCR 反应分别在两个离心管中进行。

  • 更新时间:2024-06-28
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:1274

详细介绍

品牌YLKBIO纯度详询
货号YLK10356P规格50T
供货周期现货主要用途科研实验
应用领域化工,生物产业英文名称Two-Step?qRT-PCR?Kit
运输方式低温运输保存条件-20℃保存
有效期12个月

中文名称:荧光定量RT-PCR试剂盒(两步法)

英文名称:Two-Step qRT-PCR Kit


规格及成分

成 分

十孔盒包装

2×RT Mix

40 uL(黄盖

MMLV 逆转录酶 (含 RI)

10 uL(红盖

2×qPCR MagicMix

1 mL(棕色管

定量PCR 专用模板稀释液

1 mL(绿盖

RNase-free

1 mL(蓝盖

使用手册

1 份

荧光定量RT-PCR试剂盒(两步法)低温运输,-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂

样品 RNA、PCR 引物、ROX 染料


荧光定量 RT-PCR 试剂盒(两步法) 特点:

1.    即开即用,足够 50 次 RT 反应(10uL 体系)和 50 次 qPCR 反应(20 uL 体系)。

2.    RT 和 PCR 分开进行,方便优化 RT 和 qPCR 条件,也方便一个 RT 反应用于多个不同引物的 qPCR 扩增。

3.    RT mix 中含除酶、模板和引物以外的 RT 成分,简化了反应设置步骤。

4.    qPCR mix 是 2×预配液,也简化了反应设置步骤。

5.    qPCR mix 含 qPCR 染料,无需另外加入相关荧光 PCR 染料。

6.    扩增效率高, 最长可扩增 5 Kbp 以上的 RNA。

7.    提供定量 PCR 专用模板稀释液,保证在制作标准曲线时低浓度样品的准确性。


使用方法

一、样品 RNA 的制备(本试剂盒不提供相关试剂)

1、可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA,也可以选用其他供应商的产品,但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超纯水中。

2、如果需要用 RNA 制备标准曲线,则需在此步用定量 PCR 专用模板稀释液将 RNA 样品稀释不同梯度,并分别作为下步 RT 反应的模板。

3、由于污染的 gDNA 会严重影响 RNA 的定量,因必须che底去除 RNA 样品中的gDNA 污染。用户可以另购 RNase-free DNase 来消化 RNA 样品,也可以合成只识别外显子的引物。

二:RT(逆转录)反应合成 cDNA

4、按下表配制 RT 反应体系(10 uL 体系),在每个管中加入下列成分:


成分
加入量

总 RNA

100-500 ng

2×RT mix

4 uL

MMLV 逆转录酶

1 uL

RNase-free 水

补到 10 uL







5、42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

6、85℃保温 5 秒以终止反应,然后放置在冰上待用。

7、合成的 cDNA 可以直接作为下步 qPCR 模板使用,不需要纯化。剩余样品可以放置在

-20℃长期保存。如果需要用 cDNA 制备标准曲线,则需在此步用定量 PCR 专用模板稀释液将 cDNA 样品稀释不同梯度,并分别作为下步qPCR 反应的模板。

三、qPCR(20 uL 体系)

8、在每个 PCR 管中加入下列成分:

成分

加入量

qPCR MagicMix

10 uL

cDNA 样品来于上步的 RT 反应

2 uL

PCR 正向引物(10 pmol/uL)

1 uL

PCR 反向引物(10 pmol/uL)

1 uL

自备 ROX 染料I II见注

2 uL

RNase-free

4 uL










注意:如果使用 ABI 公司的 7500,7700 和 7900 三种型号的荧光 PCR 仪器,则需用自备的 ROX 进行 Ct 值校正。对 ABI 7700 和 7900,ROX 的最佳浓度为 1×(即在每 20 uL 反应体系中加 2 uL 10×ROX)。对 ABI 7500, ROX 的最佳浓度为 0.05-0.1×(每 20 uL 反应体系加 0.1-0.2 uL 10×ROX;也可将 10×ROX 稀释到

1×,然后每个反应体系加入 1-2 uL 1×ROX)。ROX 会在溶解曲线中产生噪音,因此,如果出现了杂峰,将软件中“Passive Reference Dye"中的“ROX"选项取消打勾,然后重新分析数据。

对于iCycler IQ,MJ Opticon,MJ Chromo4,MX3000,MX4000, RotorGene3000, RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型号的荧光PCR 仪器,ROX 不是必须的但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。

9、PCR 反应参数(需要用户根据模板和引物决定,下面参数的只做参考):

过程

温度

时间

预变性

94℃

5 min

PCR 反应

40 个循环)

94℃

1 min

55℃

1 min

72℃

2 min

最后延伸

72℃

10 min




10、 实验结果分析:反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线,制作标准曲线。具体方法

随仪器不同而不同,请参考 qPCR 仪器手册。

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