免RNA提取RT-PCR试剂盒

中文名称：免RNA提取RT-PCR试剂盒

英文名称：Cell Lysate RT-PCR Kit

运输及保存

低温运输，-20℃保存，有效期两年

自备试剂

RT 引物、PCR 引物对

规格及成分

使用方法

注意：无 RNase 的环境和使用无 RNase 污染的试剂是本实验成功的关键。

强烈建议使用优利科的固相 RNase 清除剂去除工作台面的 RNase，用气相

RNase 去除空气中的 RNase。实验前需要将 95%乙醇放-70℃预冷，最好用空枪头盒盛乙醇。

一、细胞培养、裂解

1.     按常规方法培养细胞、胰/酶消化并计数。

2.     转移 1×10E5 个细胞到离心管中，400×g 离心 4 分钟。

3.     吸弃上清（即培养基），保留细胞沉淀。

4.     用 0.5 mL 溶液 A 重悬细胞，并将细胞浓度调整到 2×10E5 细胞/mL。

5.     转移 10 µL 的悬浮细胞到 0.2 mL PCR 管中，并加入 10 µL 的溶液 B，此时细胞终浓度为 10E5 细胞/mL。

6.     迅速将离心管插入浮子中，放入-70℃预冷的、95%乙醇中 1-3 分钟。10 µL 枪头盒一般能让 0.2 mL 的 PCR 管一半没入到乙醇中。

7.     在室温的水浴锅中快速解冻细胞，涡旋 10 秒后短暂离心数秒，将管中液体

（细胞裂解液）转移到新的离心管中，放冰上待用。

二、RT（逆转录）反应合成 cDNA

8.     按下表设置 RT 反应体系（以 20 µL 体系为例）:

9 .     2℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

10.     70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。也可以放置在-20℃长期保存

三、PCR 方案一（RT 产物全部用于 PCR）

11.     在上步的 RT 反应管中直接按下表加入各成分（以 100 µL 体系为例）：

  12.    直接进入第 14 步。

四、PCR 方案二（部分 RT 产物用于 PCR）

13.    按下表设置 PCR 反应体系（以 30 µL 体系为例）：

注意：RT 引物可以用做反向 PCR 引物。

14.    PCR 反应参数(需要根据模板和引物 Tm 值决定，下面的参数只做参考)：

五、电泳检测

15.    取 5-10 µL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。

免RNA提取RT-PCR试剂盒

特点如下：

1.     免 RNA 提取，从细胞裂解到 RT-PCR 或实时定量 RT-PCR 结果只需三个步骤，省略了整个 RNA 提取过程。

2.     灵敏度不低于常规方法（先提总 RNA 再进行 RT-PCR），不但可以检测到低拷贝的 RNA，还可用于检测 miRNA。

3.     整合了去除基因组 DNA 的步骤，只检测 RNA，无需担心基因组 DNA 的污染。

4.     每次只需要 10-100000 个培养细胞或含相应细胞数的痕量组织（如 LCM 样品），验证过的细胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等，但不能用于 U937 细胞系。

5.     两步法 RT-PCR，后续使用灵活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR，也可用于基于 SYBR 的荧光定量 PCR，也可用于其他定量 PCR（如 TaqMan）， 非常灵活。

6.     即适用于少量样品，也适用于平行处理大量样品及高通量筛查。

7.     本产品足够用于 50 次 20µL 体系的 RT 和 600 次 30µL 体系（或约 200 次100µL 体系）的 PCR。