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NADP磷酸酶(NADPase)试剂盒

简要描述:NADP磷酸酶(NADPase)试剂盒测定意义:
NADPase主要存在于植物组织中,是生物体内唯yi催化NADP+降解为NAD+的酶,与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。

  • 更新时间:2024-06-29
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:568

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详细介绍

品牌YLKBIOCAS详见说明书
分子式详见说明书纯度详见说明书
分子量详见说明书货号YLK-SH125
规格100管/96样、50管/48样供货周期现货
主要用途科研应用领域化工,生物产业
测定方法:微量法、可见分光光度法

NADP磷酸酶(NADPase)试剂盒说明书

                                  微量法 100/96

 

    意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

NADPase主要存在于植物组织中,是生物体内唯yi催化NADP+降解为NAD+的酶,与NADK一起调控NADNADP之间的平衡。

 

测定原理:

NADPase能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应,通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。

所需的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

 

试剂的组成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存。

试剂一:液体15 mL×1瓶, 4保存。

试剂二:粉剂×4支,-20保存;用时加入1 mL试剂一充分溶解备用,现配现用。

试剂三:粉剂×1 , 4保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4可保存一周。

试剂四:粉剂×1, 4保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4可保存一周。

试剂五:液体 25mL×1 瓶,室温保存。

试剂六:10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4保存。

0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂六20倍稀释,即取 0.5mL试剂六9.5蒸馏水,充分混匀。

定磷试剂的配制:按H2O: 试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂

              应为浅黄色,若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。

注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

 

样本的前处理:

按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

 

操作步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。

2、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)

试剂名称μL

测定管

对照管

试剂一

120

120

试剂二

40

40

37(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5min

样本

40


蒸馏水


40

 

37(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应30min后,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失),冷却后,10000g 25离心5min,取上清

 

3、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂)


标准管

空白管

测定管

对照管

0.5μmol/ml标准磷应用液

20




蒸馏水


20



上清液



20

20

定磷试剂

200

200

200

200

混匀,25室温放置30min,在 660nm处,记录各管吸光值。

 

注意事项:

1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格,要没有一点磷,若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液,一定要洗得非常干净,要先用洗洁精加水煮,再用自来水冲,最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管,避免磷污染是检测成败的关键。

2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。

 

NADPase酶活性计算:

1、按组织蛋白浓度计算:

定义:每小时每毫克组织蛋白NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。

NADPase (μmol/h/mg prot)=(C标准管×V)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷

(V×Cpr)÷T=5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

2、按样本鲜重计算:

定义:每小时每g组织NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。

NADPase (μmol/h /g鲜重)=(C标准管×V)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V÷(W× V÷V样总)÷T=5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

C标准管:标准管浓度,0.5μmol/mLV总:酶促反应总体积,0.2mLV样:加入样本体积,0.04mL V样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,0.5小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本鲜重,g

NADP磷酸酶(NADPase)试剂盒仅供科研!

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