猴痘病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

猴痘病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

商品名称：猴痘病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

Name     ：Monkey Pox Virus(MPV) SYBR qPCR Kit

猴痘病毒(Monkey Pox Virus，MPV)会引起猴痘，是一种罕见的病毒性疾病,主要发生于中部与西部非洲热带雨林国家。该病于1958年首ci在丹麦哥本哈根一实验室绿猴中发现,可引起实验用灵长类动物发病,许多非洲啮齿动物也都有猴痘病毒感染。该病毒也可感染小鼠、大鼠和兔。1970年刚果首ci报告猴痘病毒感染人类的病例。该病毒对人和动物健康造成较大损害，因此猴痘病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的猴痘病毒染料法荧光定量PCR检测试剂盒，它具有下列特点：

1.       即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2.      根据猴痘病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3.      灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4.      一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。

5.      本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。

6.      本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

【试剂组成】

低温运输、-20℃保存，有效期一年

【自备试剂】

DNA模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

【使用方法】

一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA

1.       片段作为阳性对照。

2.      标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3.      用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

4.      在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5.      换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6.      换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7.      重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8.       如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9.      用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA/提取试剂盒兼容。

三、设置qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）

10.      如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

11.      在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。

12.       盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

13.       数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471 nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500 nm，最大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14.       如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

      15.       如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。